Figlio primogenito di Cosimo I ed Eleonora di Toledo nacque il 25 marzo 1541; Francesco fin da giovane dimostrò una particolare inclinazione per gli studi scientifici, la natura e l’arte.

Nel 1564 ricevette il titolo di reggente conferitogli dal padre Cosimo I e l’anno successivo sposò Giovanna d'Austria, figlia di Ferdinando I d'Asburgo e sorella dell'imperatore Massimiliano II, il  matrimonio più prestigioso mai celebrato dalla famiglia Medici.

Nel 1574 alla morte di Cosimo I, che nel frattempo aveva ottenuto dal papa il titolo di granduca, Francesco salì sul trono, mantendendo il carattere descritto dai diplomatici del tempo, taciturno e malinconico, fortemente legato alla propria sfera privata a dispetto della vita pubblica. Francesco sposò in seconde nozze nel 1578 la nobildonna veneziana Bianca Cappello. La nuova moglie di Francesco, anche se visse molto appartata dalla vita pubblica,

Francesco preferì abitare in Palazzo Vecchio, piuttosto che nella nuova residenza granducale di Palazzo Pitti.

Amante delle arti e ricchissimo mecenate affida a Bernardo Buontalenti la fabbrica degli Uffizi e la costruzione della Tribuna (1581),destinata ad ospitare una selezione raffinata delle raccolte medicee. Nel 1583 fondò l'Accademia della Crusca e nel corso degli anni arricchì la Guardaroba medicea con oggetti molto vari,  tesori antichi e moderni, dipinti, sculture, armi, porcellane, strumenti scientifici, curiosità, opere di manifattura locale ma anche di provenienza straniera e persino esotica.

Lontano per indole dalla politica, Francesco preferì delegare gli affari di governo ai ministri per soggiornare lunghi periodi fuori città nelle residenze di campagna, in particolare nella Villa di Poggio a Caiano. Qui Francesco e Bianca vi morirono il 19 ottobre del 1587 dopo giorni di atroce agonia, a poche ore di distanza.