La nascita del Museo Nazionale del Palazzo di Venezia risale al 1916, quando  l'edificio venne recuperato dall'Austria e scelto come sede di un grande museo nazionale di arte medievale e rinascimentale.
Vi confluirono gli oggetti provenienti dal disperso Museo Kircheriano, dalla Galleria Nazionale d'Arte Antica e soprattutto le collezioni raccolte a Castel Sant'Angelo per l'Esposizione Internazionale d'Arte del 1911. Primo direttore dell'istituzione fu Federico Hermanin (1871-1953), che curò l'allestimento seguendo le regole del museo d'ambientazione, allora particolarmente in voga. 
Negli anni successivi, si aggiunsero altre prestigiose raccolte d'arte: le armi del conte Carlo Calori (1917); i dipinti medievali e rinascimentali del lascito di Enrichetta Hertz - dal 1978 passata nella Galleria Nazionale d'Arte Antica di Palazzo Barberini - tra cui era la celebre Annunciazione di Filippo Lippi; le porcellane e i dipinti del principe Fabrizio Ruffo di Motta Bagnara; le medaglie di Paolo II dell'antiquario Scipione Bonfili. Nell'immediato dopoguerra, inoltre, fu la volta di sculture lignee e opere di oreficeria sacra provenienti dai territori abruzzesi danneggiati dal terremoto della Marsica del 1915, in parte recentemente restituite.
Al primo allestimento del 1921, ne seguì un altro nel 1929, che ebbe breve durata, poiché l'ingresso del regime fascista ne causò lo spostamento nell'Appartamento Cybo e nel Palazzetto. Nel 1933 confluì nel museo la collezione più cospicua del proprio patrimonio, quella donata dai coniugi Henriette Tower e George Wurts, costituita da dipinti, pastelli su carta, sculture lignee, ceramiche, arazzi, ventagli, stoffe, mobili, argenti. 
Nel secondo dopoguerra, sotto la direzione di Antonino Santangelo (1904-65), il museo raggiunse l'estensione più ampia che abbia mai occupato, in seguito all'arrivo delle importanti collezioni di sculture in bronzo e terracotta Gorga, Pollak e Auriti, oltre a vari doni e lasciti. Il nuovo percorso di 43 sale dislocato su tutto il piano nobile è arricchito, nel 1957, dai preziosi frammenti marmorei duecenteschi, dalle stoffe copte, dalle maioliche, dalle statue lignee, dalle serrature e dagli elementi di arredo pervenuti dal disciolto Museo Artistico Industriale.
Nel 1959 lo Stato Italiano acquisì circa 1200 pezzi della collezione di armi bianche e da fuoco del principe Ladislao Odescalchi che, allestita dieci anni dopo nei Saloni monumentali, venne rimossa negli anni Ottanta per destinare l'Appartamento Barbo a sede di esposizioni temporanee. 
Dal 1983 le collezioni sono allestite lungo le sale dell'appartamento Cybo che oggi ospita raccolte divise per tipologia: dipinti, sculture lignee e pastelli, cui seguono, nel corridoio dei cardinali, le porcellane, bronzetti, mobili, maioliche, terrecotte, armi, mentre nel loggiato esterno è il lapidario. Il museo, inoltre, conserva ed espone una piccola sezione di opere medievali con avori, argenti e smalti. Nelle sale studio, visitabili su richiesta, sono raccolti argenti, avori, vetri dipinti, porcellane occidentali e orientali.